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    猪轮状病毒通用RT-PCR试剂盒

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猪轮状病毒通用RT-PCR试剂盒
产品及特点：
轮状病毒病，是由猪轮状病毒引起的猪急性肠道传染病，的主要症状为厌食、呕吐、下痢，中猪和大猪为隐性感染，没有症状。病原体除猪轮状病毒外，从小孩、犊牛、羔羊、马驹分离的轮状病毒也可感染仔猪引起不同程度的症状。轮状毒对外界环境的抵抗力较强，在 18-20℃的粪便和乳汁中，能存活 7-9 个月。本产品根据 PCR 原理开发，可用于科研领域快速检测猪轮状病毒。
1. 一站式，用户不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2. 根据猪轮状病毒通用的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3. 灵敏度可以达到 1000 拷贝/反应。
4. 使用一管式 RT-PCR 技术，RT 和 PCR 两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的 RT-PCR。
6. 本产品只能用于科研，不能用于临床。
规格及成分：

编号

成分

规格

试剂一

5×双酶一管式 RT-PCR Buffer

200 μL（橘黄盖）

试剂二

MMLV-Taq Mix

75 μL（红盖）

试剂三

超纯水

1 mL（亮黄盖）

试剂四

猪轮状病毒通用 RT-PCR 引物混合液

100 μL（白盖）

试剂五

猪轮状病毒通用 RT-PCR 阳性对照（1×10E8/μL）

50 μL（黄盖）

试剂六

使用手册

1 份

注：为避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供专一的DNA 片段作为阳性对照。 
运输及保存：
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。收到货后阳性对照需要跟其他成分分开放置，因为其容易污染其他成分，造成假阳性。
自备试剂：
样品 RNA。
使用方法：
一、样品 DNA 的制备： 
1. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 猪轮状病毒通用 PCR阳性对照的 1000 倍稀释液作为制备的阳性对照。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 RNA。
2. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。
二、设置RT-PCR反应(20 μL 体系)： 
3. 如果有 N+2 个样品，则标记 N+4 个 PCR 管（额外增加的两个管一个是RT-PCR 阳性对照，另一个是 RT-PCR 阴性对照）并按照下表在 PCR 管中加入下列成分：

成份

N+2 个

样品管

RT-PCR

阴性对照

RT-PCR

阳性对照

5×双酶一管式RT-PCR Buffer

各 4 μL

4 μL

4 μL

猪轮状病毒通用 RT-PCR 引物混合液

各 2 μL

2μL

2μL

N+2 个制备的 RNA 样品

各 12.5μL

--

--

超纯水

--

12.5μL

--

猪轮状病毒通用 RT-PCR 阳性对照的 1000倍稀释液

--

--

12.5μL

MMLV-Taq Mix

1.5 μL

1.5 μL

1.5 μL

4.上机进行 RT-PCR，RT-PCR 反应参数为:

过程

温度

时间

逆转录

42℃

30 min

预变性

95℃

5 min

PCR反应35个循环

95℃

30 sec

58℃

30 sec

72℃

20 sec

延伸

72℃

7 min

三、电泳检测： 
5. 琼脂糖电泳检测扩增效果。如果阴性对照有扩增产物或阳性对照无扩增产物，则说明实验失败，需要分析实验失败的原因。只有在阴性对照没有扩增产物、阳性对照必须有预期条带出现，才有必要分析样品的实验结果，如果有预期片段大小的扩增产物则为阳性，如果无则为阴性。 

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