HIV-1前病毒染料法荧光定量PCR试剂盒
编号
成分
规格
试剂一
2×qPCR MagicMix
500 μL(棕色管)
试剂二
荧光 PCR 专用模板稀释液
1 mL(黄盖)
试剂三
HIV-1前病毒染料法PCR 引物混合液
100 μL(白盖)
试剂四
HIV-1前病毒染料法PCR阳性对照(1×10E8)
50 μL(红盖)
试剂五
DNA 病毒裂解液(试用装)
15 次(9 mL)
使用手册
1 份
成分
样品管 N+2 个
PCR 阴性 对照管
PCR阳性对照管(2-7 管)
2×qPCR MagicMix (棕色管)
10μL
10 μL
各10μL
HIV-1前病毒PCR混合液(白盖)
2 μL
2 μL
各2μL
自备10×ROX (见注)
2 μL
2 μL
各2μL
N+2 待测样品 DNA 模板
6 μL
不加
不加
第7步所得PCR阳性对照稀释液(2-7号)
不加
不加
各 6μL(2 号样到 2 号管,3 号样到 3 号管…)
产品及特点:
人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)患者血浆中病毒 RNA 水平一直以来是评判抗病毒治疗效果或预测疾病进展的重要指标。但是,经抗病毒治疗后血浆 HIV-1RNA 已达到基线水平感染者的血液、精液或淋巴结中仍可以检测到 HIV-1原病毒 DNA 的存在,构成病毒储藏库,对清除 HIV-1病毒构成严重阻碍。所以在病毒载量已经检测不到的情况下,HIV-1原病毒 DNA 水平可以作为除 CD4+T细胞计数和病毒载量之外的另一标志物。本公司开发 HIV-1 前病毒染料法荧光定量 PCR 试剂盒,它具有下列特点:
1. 即开即用,用户只需要提供病毒样品。
2. 根据HIV-1前病毒保守序列设计的专一性引物,与相关病毒无交叉反应。
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4. 一管式荧光定量 PCR 检测,避免后续污染。
5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
规格及成分:
运输及保存:
低温运输、-20℃保存,有效期一年。
自备试剂:
DNA 模板、10×ROX(根据机型决定,具体见使用方法)。
使用方法:
一、稀释PCR阳性对照(以10E2-10E7拷贝/μL这6 个 10倍稀释度为例)
1. 注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。
2. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液(最好用带芯枪头,下同)。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡 1 分钟,得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中,充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备:
8. 如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 上步制备的 PCR 阳性对照的第 4号(浓度为 1×10E4 拷贝/μL,10μL 相当于 1 万拷贝)或第 5 号(浓度为 1×10E5拷贝/μL,10μL 相当于 10 万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL 样品,则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。
9. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。本试剂盒免费赠送 15 次一管式病毒 DNAout。
三、设置 qPCR 反应(20 μL 体系,在样品制备室进行):
10. 如果只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于 PCR 阳性对照。如果做 2-3 次重复,则反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。
11. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加):
注: 仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照,其他荧光 PCR 仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX,则用水替代。
12.盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
过程 |
温度 |
时间 |
预变性 |
92℃ |
5分钟 |
PCR反应30个循环
|
94℃ |
60秒 |
50℃ |
60秒 |
|
72℃ |
60秒 |
共有(72)人参考评价
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