伊氏锥虫探针法荧光定量PCR试剂盒
产品及特点： 
伊氏锥虫病又称“苏拉病”，是由伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）引起的一种血液原虫病，多发于热带和亚热带地区。0IE 将其列为 B 类疫病。伊氏锥虫病潜伏期为 4～11 天。急性病例多为不典型的稽留热(多在 40℃以上)或弛张热。发热期间，呼吸急促，脉搏增数，血像、尿液、精神、食欲、体质等均有明显新变化。一般在发热初期血中可检出锥虫，急性病例血中锥虫检出率与体温升高比较一致，而且有虫期长，慢性病例不规律，常见体躯下部浮肿。因此快速灵敏检测伊氏锥虫具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测伊氏锥虫的试剂盒。
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据伊氏锥虫高度保守区设计，不会跟其他病毒 DNA发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。 
规格及成分：

编号	成分	规格
试剂一	2×Probe qPCR MagicMix	500μL(本色盖)
试剂三	荧光PCR专用模板稀释液	1 mL(黄盖)
试剂二	伊氏锥虫qPCR引物混合液	100μL(白盖)
试剂四	伊氏锥虫qPCR探针	50μL(棕色管)
试剂五	伊氏锥虫探针法qPCR阳性对照(1×10E8/μL)	50μL(红盖)
	使用手册	1 份

运输及保存：
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂：
样品DNA。
使用方法：
一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）：
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。
6. 放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备：
7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）：
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）：

成份	N+2个样品管	PCR阴性对照管	标准曲线 样品管(2-7管)
2×ProbeqPCRMagicMix	10μL	10μL	各10μL
伊氏锥虫qPCR探针	1μL	1μL	各1μL
伊氏锥虫探针法qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
N+2个待测DNA模板	7μL	--	--
超纯水	--	7μL	--
第7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号)	--	--	各7μL(2号样到2号管，3号样到3号管)

11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	3min
PCR反应40个循环	95℃	15sec
	60℃	1min(采集FAM通道的荧光信号）

四、数据处理：
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。若重复结果 Ct值小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。