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    利什曼原虫通用PCR试剂盒

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利什曼原虫通用PCR试剂盒
产品及特点： 
利什曼原虫（Leishmania spp）泛指利什曼虫属的锥体虫科原虫，是一种会引起利什曼病的寄生虫。利什曼原虫的主要宿主为脊椎动物，常见的感染对象包括蹄兔目、啮齿目、犬科、和人类。目前全世界有 88 个国家报告过利什曼原虫症的病例，感染人数达 1,200 万人。对人和哺乳动物致病的利什曼原虫有：引起人体内脏利什曼病的为杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani），引起皮肤利什曼病的为热带利什曼原虫（L．tropica）和墨西哥利什曼原虫（L．mexicana），引起粘膜皮肤利什曼病的为巴西利什曼原虫（L．araziliensis）等。我国的黑热病是由杜氏利什曼原虫引起的。因此快速检测利什曼原虫具有重要意义。
本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测利什曼原虫通用的试剂盒，它具有下列特点： 
1. 即开即用，用户只需要提供DNA模板。
2. 引物经过精心优化，专一性强，只扩增利什曼原虫通用，与其他病原没有交叉反应。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. PCR mix 中含上样染料，PCR后可以直接上样电泳。
5. 本试剂盒足够做40μL体系的PCR 50次，但只能用于科研。
规格及成分：

编号

成分

规格

试剂一

PCR MagicMix 3.0

1 mL（红盖）

试剂二

超纯水

1 mL（亮黄色）

试剂三

利什曼原虫通用 PCR 引物混合液

100 μL（白盖）

试剂四

利什曼原虫通用 PCR 阳性对照（1×10E8 /μL）

50 μL（黄盖）

试剂五

使用手册

1 份

运输及保存：
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照需要单独放置，不要污染其他试剂。
自备试剂：
样品DNA。
使用方法：
一、样品 DNA 的制备：
1. 用自选方法纯化N+2个样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。可以选用本公司柱式病毒 DNAout。
2. 如果有N个样品，则需要做N+2个提取，包括一个样品制备阳性对照和一个样品制备阴性对照。样品制备阳性对照是在适量水（取决于试剂盒要求的样品起始量）中加 10μL 利什曼原虫通用 PCR 阳性对照的 1000 倍稀释液而得，样品制备阴性对照是直接用水。提取结束后得到模板 DNA 放冰上待用。
二、设置 PCR 反应（40μL 体系）：
3. 对N+2个样品，在PCR时需要增加一个PCR阳性对照和一个PCR阴性对照，故需要设置N+4个反应。在N+4个PCR管中分别加入下列成分：

成份

N+2 个样品管

PCR 阴性对照

PCR阳性对照

PCR Magic Mix 3.0

各 20μL

20μL

20μL

利什曼原虫通用PCR 引物混合液

各2μL

2μL

2μL

N+2个样品DNA模板

各18μL

--

--

PCR 阴性对照（水）

--

18μL

--

PCR 阳性对照（利什曼原虫通用PCR阳性对照1000倍稀释液）

--

--

18μL

4.按下表设置 PCR 反应：

过程

温度

时间

预变性

95℃

5 min

PCR 反应35个循环

95℃

30 sec

55℃

30 sec

72℃

40 sec

延伸

72℃

7 min

三、电泳检测：
5. 取 10-20 μL PCR 产物。电泳检测 PCR 产物。本产品提供的 PCR Mix 在 扩增结束后可以直接上样，不需要另外再加 loading buffer。PCR 产物阳 性对照必须有 551bp 大小的条带出现，阴性对照必须无任何扩增，否则实 验无效。对没有扩增产物的样品，可以稀释 10 倍后重复 PCR 扩增以排除 PCR 抑制剂的感染。

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