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    彭氏变形菌探针法荧光定量PCR试剂盒

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彭氏变形菌探针法荧光定量PCR试剂盒
产品及特点: 
1. 即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化,灵敏性高。
3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4. 特异性高,引物是根据彭氏变形菌高度保守区设计,不会跟其他病毒 DNA发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。 
规格及成分:

编号

成分

规格

试剂一

2×Probe qPCR MagicMix

500μL(本色盖)

试剂二

荧光PCR专用模板稀释液

1mL(黄盖)

试剂三

彭氏变形菌qPCR引物混合液

100μL(白盖)

试剂四

彭氏变形菌qPCR探针

50μL(棕色管)

试剂五

彭氏变形菌探针法qPCR阳性对照(1×10E8/μL)

50μL(红盖)

运输及保存:
低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。
自备试剂:
样品DNA。
使用方法: 
一、稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例):
由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。
6. 放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备:
7. 如果有 N 个样品,最好设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行):
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加):

成份

N+2 个

样品管

PCR 阴性

对照管

标准曲线样品管

(2-7管)

2×Probe qPCR MagicMix

10μL

10μL

10μL

彭氏变形菌qPCR探针

1μL

1μL

1μL

彭氏变形菌探针法qPCR引物混合液

2μL

2μL

2μL

N+2个待测DNA模板

7μL

--

--

超纯水

--

7μL

--

7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号)

--

--

7μL(2号样到2号管,3号样到3号管…)

11.盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR:

过程

温度

时间

预变性

95℃

3 min

PCR反应40个循环

95℃

15 sec

60

1 min(采集FAM通道的荧光信号)

四、数据处理:
12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log 值,再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。若重复结果 Ct值小于 40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。

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