致泻性大肠杆菌(致泻性大肠埃希氏菌)通用探针法荧光定量PCR试剂盒
产品及特点：
能够引起肠道内急性腹泻的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌(Diarrheagenic Escherichia coli，DEC)。我国发生的食物中毒事件中，细菌性食物中毒的人数最多，占总中毒人数的 42.8％，其中致泻性大肠埃希氏菌是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病的常见病原菌，在我国引起感染性腹泻的发病率居所有传染病之首，因此快速检测致泻性大肠杆菌（致泻性大肠埃希氏菌）通用具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测致泻性大肠杆菌的试剂盒。
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据致泻性大肠杆菌（致泻性大肠埃希氏菌）通用高度保守区设计，不会跟其他病毒 DNA发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
规格及成分：

编号	成分	规格
试剂一	2×Probe qPCR MagicMix	500μL（本色盖）
试剂三	荧光PCR专用模板稀释液	1mL（黄盖）
试剂二	致泻性大肠杆菌（致泻性大肠埃希氏菌）通用探针法qPCR引物混合液	100μL（白盖）
试剂四	致泻性大肠杆菌（致泻性大肠埃希氏菌）通用探针法qPCR探针	50μL（棕色管）
试剂五	致泻性大肠杆菌（致泻性大肠埃希氏菌）通用探针法qPCR阳性对照(1×10E8/μL)	50μL（红盖）
	使用手册	1份

运输及保存：
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂：
样品DNA。
使用方法：
一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）：
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。
6. 放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备：
7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）：
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）：

成份	N+2个 样品管	PCR阴性 对照管	标准曲线 样品管（2-7管）
2×Probe qPCR MagicMix	10μL	10μL	各10μL
致泻性大肠杆菌（致泻性大肠埃希氏菌）通用探针法qPCR探针	1μL	1μL	各1μL
致泻性大肠杆菌（致泻性大肠埃希氏菌）通用qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
N+2个待测DNA模板	7μL	--	--
超纯水	--	7μL	--
第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号）	--	--	各7μL（2号样到2号管，3号样到3号管）

11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	3 min
PCR反应40个循环	95℃	15 sec
	60℃	1 min（采集FAM通道的荧光信号）

四、数据处理：
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。若重复结果 Ct值小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。