活性氧（ROS）测定试剂盒
一、测定意义：
活性氧（Reactive oxygen species, ROS）包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。本试剂盒采用的 DCFH-DA(2，7-Dichlorofuorescin Diacetate)探针，是迄今最常用、最灵敏的细胞内活性氧检测探针。DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，当其进入细胞内后，会被细胞内的相关酯酶水解为 DCFH（Dichlorofluorescin）。而 DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标记到细胞内。当细胞内有活性氧存在时，DCFH 被氧化为强绿色荧光物质 DCF（Dichlorofluorescein），其荧光在激发波长 488nm，发射波长 525nm 附近有最大波峰，其荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。一般细胞内活性氧的升高是细胞凋亡的标志之一。该活性氧检测系统本底低，灵敏度高，重复性好，操作简便。
工作波长：最佳激发波长 488，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检测条件检测。
二、试剂组成及保存：
1、0.1mL 10mM DCFH-DA in DMSO，4-8℃保存。
2、1mL 活性氧阳性对照(Rousp,50mg/mL)，4-8℃保存。
三、试剂准备：
1、可将 DCFH-DA 稀释于适宜的缓冲液，如无血清培养液或者 0.01M PBS。对于不同的处理步骤，DCFH-DA工作浓度可为 100nM～20µM，需进行预实验确定合适的浓度。总体稀释倍数应在 1：500～1：1000 以上以避免 DMSO 对细胞的影响，推荐初始浓度为 10µM。另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照 1:2000~5000 稀释DCFH-DA，使装载探针时 DCFH-DA 的浓度为 2~5μmol/L。探针装载的时间也可以根据情况在 15~60 分钟内调整。
2、阳性对照可以按 1:1000 的比例使用。例如装载好探针的细胞共 1mL，可以加入 1mL 的阳性对照刺激（通常
刺激后 20~30 分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高）。对于不同细胞。活性氧对照的效果可能有较大的差异。如果在刺激后 30 分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度，反之如果活性氧升高过快则可以适当降低它的浓度 活性氧阳性对照仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。如果用户熟悉 ROS 荧光或实验没有必要采用阳性对照管，如荧光显微镜检测也可以不加该试剂。