细胞名称

MOC1细胞系

T150烧瓶

07-200-64

T75烧瓶

10-126-37

冷 冻 剂

03-374-059

45um过滤器

09-754-21

05%胰蛋白酶

sh30236.01

25%胰蛋白酶

sh30042.01

惰性谱线

MOC1,22

侵略性线

MOC2

IMDM

sh30228.02 Hams

营养混合物F10-F12

sh30026.01胎牛血清，特征-海克隆

目录 / 批次号

sh30071.03 / AWK24001

过滤1L过滤器瓶的过滤器

09-761-108

科学试剂目录编号

胰岛素：I6634-50mg　氢化可的松：H0135-1mg

EMD微孔试剂目录编号

表皮生长因子(EGF），重组人：01-107

解冻细胞系

1. 在解冻前，将21ml IMDM MOC线培养基加入到T150中(如果想解冻成T75，则将10ml加入到T75 中）

2. 将液氮从冷冻瓶中取出，喷上含有70%酒精的小瓶进行清洗。

3. 将冷冻瓶的下半部分放在37摄氏度的水浴中(不让盖子接触水，以避免污染），直到 有一小块冰漂浮着。

4. 再次用ETOH喷洒冷冻瓶，然后放在引擎盖上。将1ml培养液移液管加入到1ml细胞中，并将这 些2ml加入到已经含有培养基的T150中(使一个T150总共有22ml）。

5. 在T150烧瓶中取一些培养基，冲洗冷冻瓶，然后平板放置，以确保所有残留的细胞都留在冷 冻瓶中。

冷冻细胞系

1. 从T150中收集细胞，如下图所示

2. 在15ml锥形管中旋转成颗粒(1000 RPM x5分钟）

3. 排出上清液

4. 点击15ml圆锥形管，重悬细胞

5. 加入1.5ml IMDM MOC系培养基，在培养基中重建细胞-保持冰上

6. 管入冰时缓慢加入1.5 ml冷冻介质(在IMDM MOC线介质中制作冷冻介质-20%DMSO。例：20ml库存-加入16ml IMDM MOC线培养 基和4ml DMSO。注射器过滤器，使用um过滤器

7. 每份1毫升到3个冷冻瓶

8. 在-80摄氏度内储存不超过2周

9. 在1-2周内放入液氮溶液中

注 ： 如果需要，可增加到2ml IMDM和2ml冷冻培养基，以储存在4个小瓶中。此外，最好在冷冻细胞 前计数细胞并记录在小瓶上。

细胞系特征

1. 惰性- MOC1：基于体内研究的侵袭性较低。如果从80%合流T150通过1：12，需要2-4天才能达到80%合 流。与更具侵袭性的细胞系相比，MOC1细胞系在收获时需要的时间更长。

2. 侵袭性- MOC2：基于体内研究，更具侵袭性。如果从80%合流T150通过1：12，需要2-4天才能达到 80%合流。与惰性细胞系相比，惰性细胞系更容易从烧瓶中分离出来。

从T150收集和传递细胞/80%融合

1. 将T150中的介质倒入倾倒瓶中

2. 用10-20ml PBS清洗一次。倒出PBS清洗液。

3. 加入1.5ml 0.05%胰蛋白酶，尖端瓶，确保胰蛋白酶覆盖整个表面积，从而接触所有细胞(这样做，使细胞不会暴露在胰蛋白酶中太久），排出胰蛋白酶，然后再应用1。5ml0.25%胰蛋  白酶。

4. 放置在37C培养箱中。侵袭性细胞系孵育3-4分钟，惰性反应可达10-12 min，但在6-8 min后 检查。

５. 故意敲击烧瓶一侧的手掌几次，使细胞松动。

6. 在显微镜下检查，看细胞在培养基中是否能自由漂浮。如果大多数没有，请放回37C培养箱中 再放置3-5分钟。尽量不要让细胞在胰蛋白酶中停留，因为这样会杀死细胞。

7. 一旦所有或大部分细胞漂浮，加入10ml IMDM MOC线培养基来中和反应。

8. 移液管培养基和细胞从烧瓶中进入15ml的锥形细胞到颗粒细胞。离心机，1000 RPM x 5 min。

9. 倒出上清液。

10. 以1：12的速度通过细胞-在另外12毫升的培养基中重悬细胞。

11. 从其中取出1ml，放入新的T150烧瓶中，总体积为22ml的IMDM MOC系培养基(稀释1：12）

1２. 放回37C的培养箱中生长。应在2-4天内达到80%的合流率。

注入小鼠侧腹(异位）

所需细胞浓度：

MOC1，MOC22：(用0.15ml注射1e6细胞）=6.66e6细胞/ml

MOC2：(用0.15ml注射1e5细胞）=6.66e5细胞/ml

1. 用0获取细胞。25%的胰蛋白酶，如上所述。

2. 用IMDM MOC系培养基中和胰蛋白酶后，将细胞旋转成50ml锥形的颗粒(1000 RPM x5分钟）。注：使用50ml锥形，允许小尺寸针抽出细胞供注射。

3. 用10ml冰水PBS重悬细胞颗粒(确保尽可能多地去除含有FCS的介质），再次将细胞旋转成颗 粒(1000 RPM x5分钟）

4. 用3-6 ml冰PBS重悬细胞颗粒再次清洗细胞(体积取决于颗粒的大小，因为你将使用这个体积 来计数细胞）

5. 使用血细胞计数仪或自动细胞计数器计数每毫升的细胞，使用台盼蓝来消除死亡细胞。使用 存在的细胞总数(细胞/mlx总PBS的mlPBS），计算重悬细胞颗粒所需的体积，以达到6.66e6(MOC1，MOC22）或6.66e5 cell/ml(MOC2）浓度。

例如：MOC1的细胞计数为： 2.8e6细胞/mlx5ml(PBS）=14e6细胞总数。14e6细胞/ 6.66e6细胞/ml=2.1mlPBS将细胞颗粒悬浮在其中。

6. 再次将细胞旋转成小颗粒。倒出PBS上清液(不）。在计算体积的冰PBS中重悬颗粒以达到 适当的浓度，记住灌注上清后50ml锥形中还有 200ul。

7. 将50ml锥形冰转移，每只小鼠皮下注射0.15ml(150ul）细胞。

8. 按照标准协议注入鼠标。我们用1毫升注射器。我们用1.5英寸21号针绘制细胞，并将针切换 到½英寸26号针进行注射。

1L媒体协议

将培养基为2：1 IMDM制成营养混合物

1. 解冻胎牛血清和宾州/链球菌在37摄氏度

2. 1L过滤瓶加入626ml IMDM和313ml营养混合物

3. 添加50毫升FCS

4. 添加10ml Penn流

5. 过滤器

6. 加入1ml5mg/ml胰岛素(或500ul，10mg/ml)

注：用10ml无菌H20稀释胰岛素50mg粉末，加50ul无菌1N盐酸，4C箔保存

7. 加入40ug氢化可的松

注：将Sigma中氢化可的松酮稀释1mg氢化可的松粉制成19ml无血清IMDM和1ml 100%乙醇，制成20ml。每升使用800ul。在-20处存储等分。

8. 添加5ug EGF

注：使EGF - make 1ug/ul原液用无血清IMDM稀释，每升加入5ul。在-80处存储等分。