ELISA数据通常用光密度与对数浓度的关系图来绘制S形曲线。已知抗原浓度用于绘制标准曲线，然后通过与标准曲线的线性部分进行比较，使用该数据测量未知样品的浓度。曲线的线性区域相对较长，使ELISA结果准确且可重复。未知浓度可以直接在图表上确定，也可以使用曲线拟合软件（通常在ELISA板读数器上找到）确定。

 

    计算标准曲线的步骤是什么

 

    在ELISA实验中，计算标准曲线的一般步骤如下：

 

    1.制备标准品：制备一系列已知浓度的标准品溶液，通常涵盖一定浓度范围。这些标准品通常针对已知纯度的分子，例如蛋白质或抗体。

 

    2.测量信号强度：使用ELISA板或其他合适的实验平台对每个标准溶液进行ELISA实验，并测量产生的信号强度，例如光密度。

 

    3.绘制标准曲线：将每个标准的浓度（X轴）与其对应的信号强度（Y轴）绘制成图，然后使用适当的曲线拟合方法（例如线性拟合、4参数逻辑拟合等）对数据点进行拟合，得到标准曲线方程。

 

    4.计算未知样品的浓度：利用得到的标准曲线方程，通过测量未知样品的信号强度，即可计算出未知样品的浓度。

 

    建立浓度梯度时，应如何排列

 

    1.取出标准样品，开封前短暂离心（如1000rpm离心1分钟），使运输、贮存过程中粘附于管壁或管盖上的标准样品沉淀至管底。

 

    2.按照说明添加规定体积的指定稀释剂，室温下放置15分钟溶解，完全溶解后轻轻拍打混匀。

 

    3.准备8个干净的EP管，并用不同的浓度标记预先标记（例如S1-S8）。

 

    4.梯度稀释：按说明向每管中加入等体积的稀释液。将前一管中溶解的标准溶液等体积移入下一管（如从S1至S2），轻轻拍打10次，充分混匀。对后续每个浓度重复此过程。

 

    注：梯度稀释标准品溶液时，稀释后可短暂离心，使管盖及管壁上附着的液体沉降至管底，方便下次稀释。以每管200µL为例，可根据实际需要调整稀释体积。

 

   5. 空白对照：用稀释剂作为标准溶液的空白对照，代表0浓度。

 

    如何绘制标准曲线

 

    我们建议使用曲线拟合软件和工具（如CurveExpert和GraphPadPrism）绘制该曲线。MicrosoftExcel。将您测量的所有数据放入其中，绘制平均吸光度（y轴）与蛋白质浓度（x轴）的关系图，并为数据点选择最佳拟合曲线。

 

    使用什么样的曲线来拟合标准曲线

 

    将您测量的所有数据都放入其中，绘制平均吸光度曲线拟合软件将为数据绘图提供不同的模型选项，包括线性图、半对数图、对数/对数图以及4参数或5参数逻辑(4PL或5PL)曲线。

 

    最简单的方法是使用线性回归来拟合标准曲线。通过线性检验后，标准曲线的公式是一个简单的线性方程：y=mx+b，其中y是信号强度，x是浓度，m是斜率，b是截距。当测定浓度的上限和下限之间存在较大差异时，也可以使用半对数或对数/对数刻度。

 

    五参数逻辑拟合是一种常用的曲线拟合方法，但其更复杂且不对称。如果数据点表明在平台附近存在不对称，则5PL曲线将很有用。但是，必须收集更多数据点才能确定是否存在不对称。因此，通常建议使用更简单的4-PL来获得最佳标准曲线拟合。

 

4PL标准曲线的公式通常表示为：

 

 

    y是信号强度（吸光度），

 

    x是浓度，

 

    a是曲线的最大值，

 

    b是曲线的斜率，

 

    c是EC50值，

 

    d是曲线的最小值（或基线），表示低浓度时的信号强度。

 

    （在ELISA实验中，EC50是半数最大有效浓度（HalfMaximalEffectiveConcentration）的缩写，常用于衡量抗体对特定分子的亲和力。EC50值是指在一定的浓度范围内，抗体达到最大效应一半时的浓度。）

 

    如何才能找到LoD和LoQ

 

    检测限(LoD)是指在样品中可以可靠地检测到目标分析物，但可能无法提供准确的浓度值。定量限(LoQ)是指可以准确测量的最低浓度。在此浓度下，仪器可以提供可靠的浓度值，并且精度和准确度在可接受的范围内。

 

    理论上，“0”浓度点既是最低浓度点，也是“检测限”，但由于背景噪音影响巨大，朗伯-比尔定律在低浓度下不成立，我们通常将LoD设置为背景噪音的3倍，而LOQ则需要实验者根据实验所用ELISA试剂盒的精度进行调整，并应大于LoD，我们通常将LoQ设置为背景噪音的10倍。

 

    如何检查标准曲线

 

    通常用线性测试来检查标准曲线的精度。

 

    对于4~6个浓度单位测定绘制的标准曲线，分光光度法一般要求相关系数|r|≥0.9990，否则应查找原因予以纠正，重新绘制合格的标准曲线。

 

    可以延长标准曲线吗

 

    一旦使用曲线内指定范围以外的浓度，就没有人能保证测定的准确性。生成特定范围是为了为测定准确性提供统计信心。吸光度值超出标准曲线范围的样本应在进行ELISA染色之前稀释，以获得准确的结果。分析此类样本时，应将从标准曲线获得的浓度乘以稀释倍数。

 

    最高标准浓度的预期OD值范围是多少

 

    许多因素都会影响高标准OD值。信号会根据标准曲线制备、清洗方法、孵育变异性和板读取器校准的操作技术而变化。预计最大检测信号测量值介于1.0和3.5OD之间。

 

    为什么灵敏度值低于标准曲线范围

 

标准曲线范围已通过多个试剂盒批次和操作员的验证，确保性能可靠且准确。最低标准浓度是ELISA系统可以保证可靠测定的最低限度。低于最低标准浓度的样本值可能不准确。

 

 

    了解上述ELISA标准曲线的生成方法，结合合适的拟合模型（例如四参数逻辑回归），可以更准确地分析实验数据，并获得更可靠的结论。准确的标准曲线是ELISA实验成功的关键，理解其构建过程有助于优化实验条件，减少误差，并获得更精确的定量结果。在绘制标准曲线后，应仔细检查其线性范围，并确保待测样品的OD值落在该范围内，以保证结果的准确性。如有必要，应调整样品稀释度。