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                                 羟自由基测定试剂盒说明书 

本试剂盒仅用于科研、实验室

50T/48样
一、测定原理:
Fenton 反应是最常见的产生羟自由基的化学反应,H2O2的量和Fenton反应产生的OH·

成正比,当给予电子受体后,用griess试剂显色,形成红色物质,其呈色与OH·的多少成正
比关系。
二、试剂组成与配制:(50T/48 样)
试剂一:3%H2O2标准品贮备液 0.5ml×1支,4℃保存 3 个月。
0.03%标准品应用液的配制:3%H2O2标准贮备液∶双蒸水=1∶99 稀释,现用现配。
试剂二:底物贮备液 1ml×1支,4℃保存 3 个月。
底物应用液的配制:
①、若您的样本为抑制羟自由基,即测定管吸光度比对照管吸光度低,
则底物应用液的配制:底物贮备液∶双蒸水=1∶99 稀释,现用现配。
②、若您的样本为产生羟自由基,即测定管吸光度比对照管吸光度高,
则底物应用液的配制:底物贮备液∶双蒸水=1∶299 稀释,现用现配。
试剂三:甲液贮备液2ml×1支,4℃保存 3 个月,用时加双蒸水 1∶9 稀释成应用液。
乙液7ml×2支,4℃保存 3 个月。
试剂三应用液的配制:甲液应用液与乙液等比例混合,用多少配多少,余下4℃保存。
试剂四:液体 10ml×1瓶,4℃保存 3 个月。用时加双蒸水稀释至 100ml,制备成应用液 ...,
4℃保存。若有结晶,则放置 37℃水浴至全部溶解后再稀释。
试剂五:液体 30ml×1瓶,避光 4℃冰箱保存 3 个月。
试剂六:液体 30ml×1瓶,避光 4℃冰箱保存 3 个月。
试剂七:分析纯的冰乙酸(冰醋酸)自备。
显色剂的配制:试剂四 ...应用液 ...∶试剂五∶试剂六∶冰乙酸=8∶3∶3∶2,现用现配。
[注]: 抑制羟自由基的物质如:血清(浆)、各种组织匀浆液、口服液等;
产生羟自由基的物质如:中性白细胞、某些药物、部分植物等。
三、操作步骤:
以上配制好的应用液,先在 37℃水浴中预温 3 分种,以下操作在 37℃水浴中进行。
空白管 标准管 对照管 测定管
双蒸水(ml) 0.4 0.2 0.2
0.03% H2O2标准应用液(ml) 0.2
底物应用液(ml) 0.2 0.2
样本*(ml) 0.2
试剂三应用液(ml) 0.4 0.4 0.4 0.4
混匀,37℃反应1分钟(准确以秒表计时),从加完试剂三开始到一分钟结束,立即加
入显色剂终止反应,一次只能做一只管子。
显色剂(ml) 2 2 2 2
混匀,室温放置 20 分钟后,1cm 光径, 550nm,双蒸水调零,测各管吸光度值。
1
本试剂盒仅用于科研、实验室
*:参考取样量:血清(浆)样本用生理盐水 20 倍稀释后取 0.2ml 作检测;若您有精确微量
移液器,可直接取 0.010ml 血清(浆),再加 0.190ml 生理盐水。组织匀浆
上清,取样 0.2ml 检测。具体取样量需根据预试结果确定,详细预试方法见
附录。
四:计算及举例:
(一)、血清(浆)中抑制羟自由基能力的计算:
1、 定义:规定每毫升血清(浆)在 37℃下反应 1 分钟,使反应体系中H2O2浓度降低 1mmol/L
为一个抑制羟自由基能力单位。
2、公式:
1
(/ ) (8 824 / )
ml
U ml mmol L
− = ×× × −
抑制羟自由基能力 对照OD值 测定OD值 标准品浓度 样本测试前
标准OD值 空白OD值 . 取样量 稀释倍数
3、计算举例:
例 1:取用生理盐水 20 倍稀释后的血清 0.2ml检测抑制羟自由基能力,测得对照管吸光度
OD值为 0.785,测定管吸光度OD值为 0.464,标准管吸光度OD值为 0.443,空白管吸光
度OD值为 0.003,标准H2O2浓度为 8.824mmol/L,则计算如下:
0 785 0 464 1 8 824 20 643.75 /
(/ ) 0 443 0 003 0 2
U ml
U ml
− = × × ×= −
抑制羟自由基能力 . . . .. .
(二)、组织中抑制羟自由基能力的计算:
1、定义:规定每毫克组织蛋白在 37℃下反应1分钟,使反应体系中H2O2的浓度降低 1mmol/L
为一个抑制羟自由基能力单位。
2、公式:
(/ ) U mgprot (8 824 / ) mmol L
− ⎡ ⎤ = ×÷ ⎢ × ⎥ − ⎣ ⎦
抑制羟自由基 对照OD值 测定OD值 标准品浓度 待测样本蛋白浓度 取样量
能力 标准OD值 空白OD值 . (mgprot/ml) (0.2ml)

3、计算举例:
例 1:取5%小鼠肝组织匀浆 0.1ml 用生理盐水 10 倍稀释成 0.5%肝匀浆,取 0.2ml 检
测,测得对照管 OD 为 0.785,测定管 OD 为 0.347,标准管 OD 为 0.443,空白 OD 为 0.003,
标准浓度为 8.824mmol/L,0.5%小鼠肝匀浆的蛋白为 0.486mg/ml。
0 785 0 443 8 824 (0 486 0 2) 90 37 / (/ ) 0 347 0 003 U mgprot U mgprot
− = × ÷ ×= −
抑制羟自由基能力 . . . ... . .
(三)、溶血液中抑制羟自由基能力的计算:
1、定义:规定每毫克血红蛋白在 37℃下反应1分钟,使反应体系中H2O2的浓度降低 1mmol/L
为一个抑制羟自由基能力单位。
2、公式:
1
U mgHb / (8.824 / ) mmol L ( / ) mgHb ml
− = ×× × ÷ −
抑制羟自由基 对照OD值 测定OD值 标准品浓度 样本测试前 血红蛋白浓度
能力( ) 标准OD值 空白OD值 取样量 稀释倍数
3、计算举例:
例 1:取抗凝红细胞 0.2ml 加冷双蒸水 0.8ml,旋涡混匀器充分混匀 1 分钟制得溶血液,
同时测定血红蛋白为 41.182mgHb/ml。取 0.01ml 溶血液加 5.99ml 双蒸水,充分混匀
后取 0.2ml 按操作表进行检测,测得对照管 OD 为 0.785,测定管 OD 为 0.615,标准管
OD 为 0.443,标准空白 OD 为 0.003,标准浓度为 8.824mmol/L,则计算结果为:
2
本试剂盒仅用于科研、实验室
0 785 0 615 1 8 824 600 41.182 248.36 /
(/ ) 0 443 0 003 0.2 U mgHb U mgHb
− = × ×× ÷ = −
抑制羟自由基能力 . . . . .
例 2:取抗凝红细胞 0.2ml 加冷双蒸水 0.8ml,旋涡混匀器充分混匀 1 分钟制得溶血液,
同时测定血红蛋白为 53.684mgHb/ml。取 0.01ml 溶血液加 5.99ml 双蒸水,充分混匀后
取 0.2ml 按操作表进行检测,测得对照管 OD 为 0.785,测定管 OD 为 0.304,标准管 OD
为 0.443,标准空白 OD 为 0.003,标准浓度为 8.824mmol/L,则计算结果为:
0 785 0 304 1 8 824 600 53.684 539.06 /
(/ ) 0 443 0 003 0.2 U mgHb U mgHb
− = × ×× ÷ = −
抑制羟自由基能力 . . . . .
(四)、产生羟自由基能力的计算:
1、定义:规定每毫升或每毫克物质或每立方厘米内 106
个细胞在本反应体系中使反应液中
H2O2的浓度增加 1mmol/L为一个产生羟自由基能力单位。
2、公式:
( )
1
(/ ) 8 824 /
OD OD ml
U ml OD OD mmol L
− = ×× × −
产生羟自由基能力 测定 值 对照 值 标准品浓度 样本测试前
标准 值 空白 值 . 取样量 的稀释倍数

3、计算举例:
例 1:某中药物质稀释 10 倍后取 0.2ml 检测,结果如下:标准空白管 OD 值为 0.003,标
准管 OD 值为 0.443,对照管 OD 值为 0.217,测定管 OD 值为 0.621。则计算如下:
0 621 0 217 1 8 824 10 405.10 /
(/ ) 0 443 0 003 0 2
U ml
U ml
− = × × ×= −
产生羟自由基能力 . . . .. .
五、注意点:
1、 必须每一只管子单独做,并且反应时间一分钟一定要准确。
2、必须严格按照操作表顺序加试剂,不可配制混合试剂。
3、检测样本溶剂或介质可为生理盐水、双蒸水、醋酸、无水乙醇,但不能为磷酸缓冲液。
4、此法检测灵敏度较高,检测血清(浆)和组织以外样本时,最好先取原液及不同浓度稀
释后的样本,例如 5 倍稀释液或 10 倍稀释液做预试。如测定管颜色太浅可将样本用其溶
剂继续稀释至颜色较深为止。我所曾检测花粉的水提液的羟自由基,将其原液稀释 150
倍后,显色较好。
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本试剂盒仅用于科研、实验室
附录Ⅰ:羟自由基最佳取样浓度及最佳取样量摸索
一、样本前处理:
1、血清(浆):用生理盐水将血清(浆)按 1︰1、1︰4、1︰9、1︰19 等稀释成一系列不同
浓度的血清(浆),分别取不同浓度的血清(浆)0.2ml 按血清(浆)的测定操作表
进行检测。
2、组织匀浆、细胞、线粒体或细胞膜等组织:分别用生理盐水将组织匀浆液稀释成 10%、5%、
2%、1%、0.5%、0.1%等一系列不同浓度的组织匀浆,分别取不同浓度的组织匀浆 0.2ml
按组织的测定操作表进行检测。
二、操作步骤(以血浆样本为例作最佳取样浓度摸索):
1、样本来源:正常组大鼠眼眶取全血,肝素抗凝取血浆进行测定。
2、样本稀释:用生理盐水将血浆按 1︰1、1︰4、1︰9、1︰19、1︰49、1︰99 稀释成一系列
不同浓度的血浆,分别取不同浓度的血浆 0.2ml 按血清(浆)的测定操作表进
行检测。
3、操作表:
空白管 标准管 对照管 测定管
双蒸水(ml) 0.4 0.2 0.2
0.03%H2O2标准应用液(ml) 0.2
试剂二(底物应用液)(ml) 0.2 0.2
样本*(ml) 0.2
试剂三(ml) 0.4 0.4 0.4 0.4
混匀,37℃反应1分钟(准确以秒表计时),从加完试剂三开始到一分钟结束,立即加
入显色剂终止反应,一次只能做一只管子。
显色剂(ml) 2 2 2 2
混匀,室温放置 20 分钟后,1cm 光径, 550nm,双蒸水调零,测各管吸光度值。
4、预试结果:
对照 0.785 空白 0.003 标准 0.443
稀释倍数 1:1 1:4 1:9 1:19 1:49 1:99
吸光度值 0.105 0.132 0.188 0.408 0.677 0.741
抑制率 86.59% 83.16% 76.01% 47.99% 13.71% 5.66%
5、结论:
100% % %
1 19 1 19 0.2ml
OD OD
OD
− = × ∼ 对照 值 测定 值 从上面的数据统计可以看出,抑制率(抑制率 )在45 55 对照 值
之间的最佳取样浓度为 : ,即取 : 稀释正常组大鼠血浆 进行羟自由基正式检测。

三、讨论:
100% 20% 55% OD OD
OD
− = ×


在您进行正式检测之前,需要从每组中取2 3个样本进行上面的预实验,确定最佳浓度
对照 值 测定 值 和最佳取样量;在保证抑制率(抑制率 )在 之间的 对照 值
同时,每组之间也应该有所差异,如果您有疑问,则需要重新摸索最佳浓度和最佳取样量。

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