• 硫氧还蛋白氧化还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)试剂盒
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    thioredoxin reductase,TrxR

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微量法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

TrxR是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶,属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员,与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR与GR活性类似, 催化GSSG还原生成GSH,是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。


测定原理:

TrxR催化NADPH还原DTNB生成TNB和NADP+,TNB在412nm有特征吸收峰,通过测定412nm波长处TNB的增加速率,即可计算TrxR活性。


自备仪器和用品:

低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。


试剂组成和配制:

试剂一:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1 瓶,4℃避光保存。临用前加入 2mL 蒸馏水溶解。试剂三:粉剂×1 管,4℃保存。临用前加入 2mL 蒸馏水溶解。

粗酶液提取:

1.组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。
2.细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500 万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3.血清等液体:直接测定。


TrxR 测定操作:

1.分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到412nm,用蒸馏水调零。
2.试剂一在25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)预热30min。
3.空白管:取微量玻璃比色皿或96孔板,加入20μL试剂二,20μL试剂三,160μL试剂一,迅速混匀后于412nm 测定10s和310s吸光度,记为A1和A2。△A空白管=A2-A1。
4.测定管:取微量玻璃比色皿或96孔板,加入20μL试剂二,20μL试剂三,140μL试剂一,20μ L上清液,迅速混匀后于412nm测定10s和310s吸光度,记为A3和A4。△A 测定管=A4-A3。
注意:空白管只需测定一次。


TrxR 活性计算公式:

(1).按蛋白浓度计算
活性单位定义:在25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR(nmol/min/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T
= 147×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

(2).按样本质量计算
活性单位定义:在25℃或者37℃中,每克样本每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR(nmol/min/g)=(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T
= 147×(△A 测定管-△A 空白管)÷W


(3)
按细胞数量计算

活性单位定义:在25℃或者37℃中,每104个细胞每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR(nmol/min/104cell)=(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷
T= 147×(△A 测定管-△A 空白管)÷ 细胞数量


(4)按液体体积计算

活性单位定义:在25℃或者37℃中,每毫升液体每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR(nmol/min /mL)=(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T
= 147×(△A 测定管-△A 空白管)
ε:TNB 在412nm处的微摩尔消光系数,0.0136 L/μmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应体系总体积(L),200μL=2×10 -4 L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;W : 样品质量;V 样:加入反应体系中上清液体积(mL),20μL=0.02 mL;V 样总:提取液体积, 1 mL;T:反应时间(min),5 min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下


(1). 按蛋白浓度计算


活性单位定义:在25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR(nmol/min/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T

= 294×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义:在25℃或者37℃中,每克样本每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR(nmol/min/g)=(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T
= 294×(△A 测定管-△A 空白管)÷W


(3)按细胞数量计算

活性单位定义:在25℃或者37℃中,每104个细胞每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR(nmol/min/104cell)=(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V样÷V 样总)÷
T= 294×(△A 测定管-△A 空白管)÷ 细胞数量


(4)按液体体积计算

活性单位定义:在25℃或者37℃中,每毫升液体每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR(nmol/min/mL)=(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T
= 294×(△A 测定管-△A 空白管)
ε:TNB 在412nm处的微摩尔消光系数,0.0136 L/μ mol/cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 反总:反应体系总体积(L),200μL=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;W :样品质量;V 样:加入反应体系中上清液体积(mL),20μL=0.02 mL;V 样总: 提取液体积,1 mL;T:反应时间(min),5 min。


注意事项:

1. 测定前须先取 1~2 个样做预实验,使得吸光值在 5min 内程线性变化。哺乳动物组织及血液制品 TrxR 活力测定时,一般须用蒸馏水稀释 5 倍左右;测定过程操作须迅速。
2. 试剂二和试剂三配制好后 3 天内使用完。

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