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JLC13006-96T 96T 准现货 询价
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微量法

规格:100 管/96 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

α-KGDH(EC 1.2.4.2)广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中,是三羧酸循环调控关键酶之一,催化 α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶 A。

测定原理

α-KGDH 催化α-酮戊二酸、NAD+和辅酶 A 生成琥珀酰辅酶 A、二氧化碳和 NADH,NADH 在 340nm有特征吸收峰,以 NADH 的生成速率表示α-KGDH 活性。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一:100mL×1 瓶,-20℃保存; 试剂二:20mL×1 瓶,-20℃保存; 试剂三:1.5mL×1 支,-20℃保存;
试剂四:液体 20mL×1 瓶,4℃保存; 试剂五:粉剂×1 瓶,-20℃保存;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1、称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆 600g,4℃离心 5min。
3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。
4、上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的α-KGDH(此步可选做)。
5、在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎,冰浴,功率 20%或 200W, 超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),用于线粒体α-KGDH 活性测定。

测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)在试剂五中加入 18mL 试剂四充分溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min;现配现用;
(2)在试剂六中加入 1mL 蒸馏水,充分溶解待用;现配现用;
(3)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂六和 180μL 试剂五,混匀,立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2,计算ΔA=A2-A1。

α-KGDH 活性计算
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
α-KGDH 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T
=1608×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟生成 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

α-KGDH(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W×V 样÷V 样总) ÷T=325×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
α-KGDH 活性( nmol/min/104cell) =[ ΔA× V 反总÷( ε×d)×109]÷(500 × V 样÷ V 样总)÷ T=0.65×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10 -4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×10 3 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;
T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数, 500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。
α-KGDH 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=3216×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟生成 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。

α-KGDH 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总(÷

(3)按细菌或细胞密度计算:
ε×d)×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=650×ΔA÷W

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。
α-KGDH 活性(nmol/min/104cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.3
×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10 -4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;
T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数, 500 万。

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