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    Caspase-8Activity Assay Kit

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  • 产品信息

英文名称 ：Caspase-8Activity Assay Kit
储存条件 ：6个月
产品包装 ：盒装
检测方法 ：比色法 
有 效 期 ：-20℃
产品规格 ：20T 、50T 、100T
产品组成：

试剂名称/规格

20T

50T

100T

保存条件

试剂一

液体20mL×1瓶

液体20 mL×1瓶

液体25 mL×1瓶

-20℃保存

试剂二

液体30 mL×1瓶

液体60 mL×1瓶

液体120mL×1瓶

-20℃保存

试剂三

液体0.25L×1支

液体0.55mL×1 支

液体0.55mL×2支

-20℃保存

标准品

液体1mL×1支

液体1 mL×1支

液体1 mL×1 支

-20℃保存

溶液的配制：
1 、试剂一：分装-20℃保存。
2 、试剂二：分装-20℃保存。
3 、标准液：pNA 标准溶液，5mmol/L。标准溶液在 4℃条件下为浑浊状态，溶解即可变为澄清状态，不影响使用。
4 、标准品稀释液配制： 取9 mL试剂一加入1 mL 试剂二，充分混匀待用。（也可按照试剂一：试剂二=9:1 的比例，自行配制） 。
产品说明：
Caspase 是参与细胞凋亡过程的蛋白酶家族， 包含10多个成员。Caspase-8 也称 FLICE 、MACH 或 Mch5，通 常以酶原的形式存在，凋亡时激活， 被认为是细胞凋亡转导过程的上游 caspase。在 Fas-receptor 和 TNFR- 1 介导 的凋亡过程中 caspase-8 被激活形成二聚体，进而激活下游 caspase-4、6、9 、10。
本试剂盒测定原理基于Caspase-8特异水解其多肽底物Ac-IETD-pNA (N-acetyl-Ile-Glu-Thr-Asp-p-nitroanilide)， 释放出游离的硝基苯胺 pNA，后者呈黄色在 405nm具有大吸收峰，采用可见光光度比色法进行测定。其吸光 度值对应于 Caspase-8 的水解活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、100μL玻璃比色皿/96孔板、 台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、研 钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、样本处理（可适当调整待测样本量）
1、培养细胞： 先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（约106⁶个）加100  μL 试剂二（若裂解不充分可提高至 150-200μL），震荡重悬沉淀， 置冰上静置 15 min，4℃ , 15000g离心 10- 15min ，取上清置冰上 待测。
2、组织： 按照组织质量（g）：试剂二体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入1 mL试 剂二），冰浴研磨或充分剪碎，置冰上静置 15 min ，4℃ , 15000g 离心 10- 15min ，取上清置冰上待测。
二、测定步骤
1 、可见分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 405nm，蒸馏水调零。
2 、临用前用标准品稀释液将 5 mmol/L pNA 标准品稀释至 200 、100 、50 、25 、12.5 、0μmol/L 的标准溶液待用。
3 、样本测定（在 96 孔板/EP 管中按顺序加入以下试剂）

试剂名称(μL）

测定管

空白管

标准管

试剂一

40

40

 

样本

50

 

 

试剂二

 

50

 

试剂三

10

10

 

标准溶液

 

 

100

混匀， 盖紧 96 孔板盖子并用封口膜密封。 37℃孵育 60- 120 分钟。 发现颜色变化比较明显时即可测定 405nm 处吸光值。如果颜色变化不明 显， 可以适当延长孵育时间， 甚至可以孵育过夜。空白管只需做 1-2 次。 计算 ΔA 测定=A 测定管-A 空白管。

立即测定405nm下吸光度

三、 Caspase-8活性计算
1.  标准曲线的建立：
根据标准管的浓度（x ，μmol/L）和 ΔA 标准（y，减去浓度为0的空白管） 做标准方程。将 ΔA 测定代入标 准方程得到 x(μmol/L）。
2.  按酶活性增加百分比计算
Caspase-8 活性增加百分比=（实验处理组 A 测定-A 空白管）/（实验对照组 A 测定-A 空白管）×100% 该方法简单可靠，可粗略反应酶活性情况。
3.  按酶活计算 
参考 Chemicon 公司的 caspase 酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底 物饱和时， 在 37℃一个小时内可以剪切 1nmol pNA 底物产生 1nmol 游离 pNA 的酶量。这样就可以计算出样品中 含有多少个酶活力单位的 caspase 酶活性。
Caspase-8 活性（U/mg prot）=x×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T×10³=2x÷Cpr÷T

V 反总： 反应体系总体积，0.1mL=10-⁴L；V 样：加入的样本体积，0.05mL；T：反应时间，h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；10³：单位换算系数，1μmol =10³nmol。

注意事项：

1、由于试剂二中含有还原剂（DTT），建议将样品用水稀释2倍后，用Bradford 法测定蛋白浓度，以降低 DTT 对蛋白浓度测定的干扰。 不建议使用 BCA法测定蛋白浓度。
2、Caspase活性测定值低常见的原因是细胞未发生凋亡或细胞量太少，其次是观测时间不恰当。诱导凋亡时， 并非剂量越大时间越长 Caspase 活性就越高。建议设置不同剂量和时间点如 0、2 、4 、8、16、24 小时，以检 测佳的观察点。
3、所测样本的值高于标准曲线上限时，可用试剂二稀释样本后重新测定。
4、盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37 ºC孵育，肉眼可见颜色变黄时的OD405 值约为 0.2，此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失去线性关系。

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