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    ATP Content Assay Kit(WST-1 Method)

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JLC-E9304-50T/48S 50T/48S 准现货 询价
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  • 产品信息

英文名称 ：ATP Content Assay Kit(WST-1 Method)
产品包装 ：盒装
产品规格 ：50T/48S
储存条件 ：-20℃
检测方法 ：可见分光光度法
有 效 期 ：6个月
产品组成：

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 60 mL×1 瓶

2-8℃保存

试剂一

液体 45 mL×1 瓶

2-8℃保存

试剂二

粉剂×1 瓶

2-8℃保存

试剂三

液体 8 mL×1 瓶

2-8℃保存

试剂四

粉剂×3 支

-20℃保存

试剂五

粉剂×1 瓶

2-8℃保存

试剂六

粉剂×3 支

-20℃保存

试剂七

液体 12 mL×1 瓶

2-8℃保存

标准品

粉剂×1 支

-20℃保存

溶液的配制：
1.提取液：低温条件下，可能有结晶析出， 放于 60℃水浴加热溶解即可， 不影响使用；
2.试剂二：临用前加入 7 mL 蒸馏水充分溶解，可加热促进溶解， 用不完的试剂 2-8℃保存 4 周；
3.试剂四：临用前取 1支加入0.2mL蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存 2 周， 避免反复冻融；
4.试剂五：临用前加入3.2 mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；
5.试剂六：临用前取 1 支加入 0.25 mL 蒸馏水备用， 用不完的试剂-20℃分装保存 2 周，避免反复冻融；
6. 标准品：5 mg ATP。临用前加入 0.826 mL 蒸馏水配成10μmol/mL的ATP标准溶液，用不完的试剂-20℃ 分装保存 4 周， 避免反复冻融；
7. 0.3125μmol/mL 标准溶液的配制：临用前吸取 20μL 10 μmol/mL 的ATP标准溶液和620μL蒸馏水混合配制成 0.3125μmol/mL 标准溶液，用于标准管的测定；
8. 工作液的配制： 临用前请按试剂二： 试剂三： 试剂四：试剂五： 试剂六=1mL：1mL：0.1mL：0.4mL：0.1mL 的比例配制（2.6mL，约 10T 的量），现配现用。
产品简介 ：TP广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物能量通货，能荷是描述细胞能量代谢状态的主要参数。测定ATP含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。
HK催化葡萄糖和ATP合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，WST-1可与NADPH 反应，产生水溶性 formazan，在450nm下有特征吸收峰。





注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、低温离心机、可调式移液枪、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器/超声波 细胞破碎仪、蒸馏水、冰和氯仿。
操作步骤：
一、样本处理(可适当调整待测样本量)
1 、血清（浆）中 ATP的提取：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积（mL）为 1：5~10的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入1mL提取液）混合， 充分震荡，10000g，4℃离心10min；取上清液至另一EP管中，加入 500μL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心 3min，取上清， 置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。
2 、组织中 ATP  的提取： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10的比例（建议称取约 0.1g  组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆,10000g 4℃离心10min，取上清至另一EP 管中，加入 500μL 的氯仿充分震荡 混匀,10000g 4℃离心 3min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。
3 、细胞或细菌中 ATP  的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液 体积（mL）为 500~1000：1  的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎（冰浴，功率 200W，超声 2s，停 1s，总时间 1min）， 10000g 4℃离心 10min；取上清液至另一EP 管中，加入500μL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心 3min，取上清， 置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定）。
注：以上提取过程严格控制在冰浴条件下进行。
二、测定步骤
1 、可见分光光度计预热30min以上，调节波长到450nm，蒸馏水调零。
2 、试剂一置于37℃水浴锅/恒温培养箱中预热15min以上。
3 、操作表：（按下表在1.5mLEP管中加入相应试剂）

试剂名称(μL)

测定管

标准管

空白管

样本

100

-

-

标准溶液

-

100

-

蒸馏水

-

-

100

试剂一

650

650

650

工作液

250

250

250

混匀， 置于 37℃水浴锅/恒温培养箱中培养 1h

试剂七

150

150

150

充分混匀，于1mL玻璃比色皿测定 450nm 处的吸光值，记为A测定、A 标准、A空白，计算ΔA测定=A测定-A空白，ΔA标准=A标准-A空白(空白管和标准管只需做1-2次）。
三、 ATP 含量计算
1. 血清（浆）中ATP含量计算
ATP含量(μmol/mL) = C 标准×ΔA 测定÷ΔA 标准×（V 提取+V 血清（浆）÷V 血清（浆） = 3.4375×ΔA 测定÷ΔA 标准
2. 按样本质量计算
ATP含量(μmol/g 质量）= C标准×ΔA测定÷ΔA 标准×V提取÷W =0.3125×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W
3. 按蛋白浓度计算：
ATP含量(μmol/mg prot）= C 标准×ΔA 测定÷ΔA 标准×V 样本÷(V样本×Cpr）=0.3125×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr
4. 按细菌或细胞数量计算
ATP含量(μmol/10⁴cell）= C 标准×ΔA测定÷ΔA标准×V提取÷N = 0.3125×ΔA测定÷ΔA标准÷N
C 标准：标准溶液浓度，0.3125μmol/mL；V 提取：加入的提取液体积，1mL；V 血清（浆）：血清（浆)体积， 0.1mL；V样本：反应体系中加入的样本体积，0.1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；N：细胞或细菌总数，按10⁴个。
注意事项：
1、加入提取液离心后的上清若为浑浊为正常现象。
2、如果 ΔA 测定>1.5，建议将样本用蒸馏水稀释后进行测定。注意计算公式中乘以稀释倍数；如果吸光值过低 或接近空白，建议统一放置于 37℃水浴锅/恒温培养箱中培养2h或更长时间后再次测定， 也可以加大样本量后进 行测定，注意同步修改计算公式。
3、提取液中含蛋白变性成分，若按蛋白浓度计算需要另取样本重新计算。
实验实例：
1 、取0.108g小鼠脑加入1mL提取液进行冰浴匀浆，10000g 4℃离心10min，取上清至另一EP 管中，加入500μL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心3min，取上清，置冰上按照测定步骤操作，使用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=0.283-0.154=0.129 ，ΔA标准=A标准-A空白=0.569-0.154=0.415,按样本质量计算含量得：ATP含量(μmol/g质量)=0.3125×ΔA测定÷ΔA 标准÷W=0.899μmol/g 质量。
2 、取 0.111g绿萝叶片加入1mL提取液进行冰浴匀浆，10000g 4℃离心10min，取上清至另一EP管中，加入500μL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心3min，取上清，置冰上按照测定步骤操作,使用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=0.387-0.154=0.233 ，ΔA标准=A标准-A 空白=0.569-0.154=0.415,按样本质量计算含量得：ATP含量(μmol/g 质量）=0.3125×ΔA测定÷ΔA 标准÷W=1.58μmol/g质量。

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