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JLC-E9313-100T/48S 100T/48S 准现货 询价
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  • 产品信息

中文名称 ：D-乳酸(D-LA)含量检测试剂盒(WST显色法)微量法

英文名称 ：D-Lactic acid(D-LA)Content Assay Kit
产品包装 ：盒装
产品规格 ：100T/48S
储存条件 ：-20℃
检测方法 ：微量法
有 效 期 ： 6个月
产品组成：

试剂名称

规格

保存条件

提取液一

液体 60mL×1 瓶

2-8℃保存

提取液二

液体 10mL×1 瓶

2-8℃保存

试剂一

液体10mL×1 瓶

2-8℃保存

试剂二

粉剂×1支

-20℃保存

试剂三

粉剂×1 瓶

-20℃保存

试剂四

液体 4 mL×1 瓶

2-8℃保存

标准品

液体 1mL×1 支

-20℃保存

溶液的配制：
1、试剂二：临用前取一支加入160μL蒸馏水溶解。2-8℃可以保存4周(该试剂为冻干试剂，可能存在肉眼观察试剂量相差较大甚至量很少的现象，此现象不影响使用，实际质量相同）；
2、试剂二工作液的配制：临用前按试剂二（V）：蒸馏水（V）=10μL：90μL（1T)的比例配制，现用现配，用多少配多少；
3、试剂三：临用前加入15 mL蒸馏水混匀，可分装后-20℃保存，避免反复冻融,-20℃保存 4 周；
4、标准品：1000μmol/mL D-乳酸标准液。临用前取 20μL 1000μmol/mL D-乳酸标准液和1980μL蒸馏水混合配成10μmol/mL标准溶液；再吸取20μL 10μmol/mL标准溶液和620μL蒸馏水混合配成0.3125μmol/mL标准溶液备用。
产品简介 ：乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物，与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关，乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。D-乳酸在D-乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸，同时使NAD+还原生成NADH和H+，在1-mPMS作用下，WST-1可与NADH反应，产生水溶性formazan，其在450nm处有最大吸收峰，据此可计算D-乳酸含量。




注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、分析天平、研钵/匀浆器/超声波细胞破碎仪、离心机、1m玻璃比色皿、水浴锅/恒温培养箱、蒸馏水和冰。
操作步骤：
一、样本处理(可适当调整待测样本量)
1. 组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取 液一，冰浴匀浆后于4℃ , 12000g离心10min，取0.8mL上清液， 再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至 无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。
2.  细胞：按照细胞数量（10⁴个） ：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液 一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃ , 12000g离心10min，取 0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生， 4℃12000g离心10min后取上清待测。
3. 血清（浆）等液体：取100μL液体加入1mL提取液一，4℃ 12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL 提取液二， 缓慢吹打混匀至无气泡产生，12000g离心10min后取上清待测。
注： 提取液二需缓慢加入，加入后会产生大量气泡，建议使用2mL EP管进行操作。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上， 波长调至450nm，蒸馏水调零。
2、加样表：（按顺序将下列试剂加在EP管中）

试剂名称(μL)

测定管

对照管

标准管

空白管

样本

20

20

-

-

标准溶液

-

-

20

-

蒸馏水

-

20

-

20

试剂一

90

90

90

90

试剂二工作液

20

-

20

20

试剂三

40

40

40

40

试剂四

30

30

30

30

充分混匀，于 37℃水浴锅/恒温培养箱避光准确反应30min，取全部反应液到 1mL 比色皿中，于 450nm处测定吸光值，分别记为 A 测定管，A对照管，A标准管， A 空白管， 计算ΔA测定=A测定管-A对照管； ΔA标准=A标准管-A 空白管。每个测定管需设置一个对照管， 空白管和标准管只需测定 1-2 次。

三、 D-乳酸含量的计算
1. 按照蛋白含量计算
D-LA含量(μmol/mg prot）= ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准）×V样本÷（V样本×Cpr）
= 0.3125×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr
2. 按照样本质量计算
D-LA含量(μmol/g质量）
= ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准) ×(V上清+V提取液二)÷（W×V上清÷V提取液一） =0.3711×ΔA测定÷ΔA标准÷W
3.按照细胞数量计算
D-LA含量(μmol/10⁶cell）
= ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准)×(V上清+V提取液二）÷（N×V上清÷V提取液一）
= 0.3711×ΔA测定÷ΔA标准÷N
4. 按照液体体积计算
D-LA含量(μmol/mL）
=ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准) ×（V上清+V提取液二）÷[V液体×V上清÷（V提取液一+V液体） ] =4.082×ΔA测定÷ΔA标准
C标准：标准溶液浓度，0.3125μmol/mL；V样本：加入的样本体积，0.1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋 白质浓度, mg/mL，蛋白浓度需自行测定； V上清：提取时上清液体积， 0.8mL；V提取液二：加入的提取液二体 积, 0.15mL；V提取液一：加入的提取液一体积，1mL；N：细胞数量，以10⁶计；V液体：液体样本体积，0.1mL。
注意事项：
1. 提取液一中含有蛋白质沉淀剂， 因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取组织。
2. ΔA测定的测定范围在0.01- 1.2之间。如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以用蒸馏水稀释样本后再次测定，如果测定吸光值小于线性范围吸光值,需要增加样本量后再次测定，注意同步计算公式。
实验实例：
1、取0.10⁴g 兔肌肉加入 1mL 提取液一，冰浴匀浆后离心，取 0.8mL上清后加 0.15mL 提取液二， 离心取上清后 按照测定步骤操作， 使用 96 孔板测得计算 ΔA 测定管=A测定-A对照=0.321-0.179=0.142，ΔA 标准=A 标准管-A空白管=0.405-0.122=0.283，按样本质量计算含量得：
D-LA含量(μmol/g质量）= 0.3711×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W =1.7904 μmol/g质量。
2 、取 100μL牛血清加入 1mL 提取液一，离心，取 0.8mL上清后加 0.15mL提取液二，离心取上清，之后按照测 定步骤操作，使用 96 孔板测得计算 ΔA 测定管=A测定-A 对照=0.221-0.169=0.052,ΔA标准=A 标准管-A空白管=0.405-0.122=0.283，按照液体体积计算含量得：
D-LA 含量(μmol/mL)= 4.082×ΔA 测定÷ΔA 标准=0.75μmol/mL。

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